本文章仅讨论ALK分离探针的结果判读，EML4-ALK双色融合探针或者EML4-ALK三色探针不在本文章讨论范围。

ALK分离探针设计方案：ALK基因断裂探针采用橘红色染料标记ALK基因（3’端）2p23.2区域，采用绿色染料标记ALK基因（5’端）2p23.1-p23.2区域。ALK基因断裂探针能够检测所有ALK基因重排，避免了单独检测某一融合基因（如EML4-ALK）导致的漏诊。

可计数的组织区域应该为很好区分的肿瘤细胞区域，如图1和图2所示，圆圈标记的区域为可计数区域，黄色箭头指示的区域为不可计数区域，因为细胞被基质环绕，只有少量的细胞分散其中。

如图3和图4所示，当组织前处理和酶消化充足时，细胞核完整，边界清晰，细胞之间没有重叠，很容易区分信号点属于哪个细胞，这样的细胞区域可以作为计数区域。

图3

图4

可计数的细胞杂交信号应该是明亮、清楚和容易判读的，如图5和图6所示。选取的细胞没有荧光背景干扰荧光信号，如图7和图8所示。

图5 

图6

图7

图8

如图9所示，不能区分细胞边界，细胞成块，这样的细胞区域不能计数。如图10所示，当前处理或者酶消化不充足时，细胞之间被基质和没有消化的物质环绕，这种细胞区域也不能作为计数区域。

图9

图10

当在DAPI通道下观察细胞时，细胞核边界不可区分，如图11所示，细胞核观察比较困难，原因是DAPI染色不充分；当组织酶消化不充足时，细胞被基质包围，导致细胞边界模糊，如图12所示，这两种情况的细胞区域都不能用来计数。

图11

图12

如图13所示，细胞核重叠在一起，无法区分细胞边界，不能作为计数细胞区域。如图14所示，红绿信号均比较弱，也不能作为计数细胞区域，原因可能是细胞固定不合理。

图13

图14

当红色和绿色信号很弱或者没有信号，细胞边界模糊不清，细胞形态不规则和高背景，如图15和图16所示，不能作为计数细胞区域，出现这种情况的原因可能是消化过度。

图15

图16

当视野里出现明亮的荧光颗粒背景使得特异的探针信号变模糊，如图17所示，这样的区域不能作为计数细胞区域。如图18所示，朦胧的荧光背景使得荧光信号不清楚，这样的荧光背景区域也不能作为计数区域。

图17

图18

当组织出现损伤或者丢失，DAPI染色弱，细胞核呈现碎片形状，如图19所示；当组织细胞发生凋亡，细胞核降解，DAPI染色弱，如图20所示，这两种情况的细胞核不完整，不能作为计数细胞。

图19

图20

当细胞之间重叠成块，使得细胞核边界不能区分，如图21所示，这样的细胞不能作为计数细胞。荧光颗粒背景使得探针信号变模糊，干扰计数，如图22所示，这样的细胞也不能作为计数细胞。

图21

图22

当荧光信号较弱，荧光背景较高，干扰细胞计数，如图23所示，这样的细胞不能作为计数细胞。当细胞里的荧光信号只有红色或者绿色信号时，如图24所示，这样的细胞也不能作为计数细胞。

图23

图24

典型的ALK阳性信号模式为一绿一红一融合信号模式（1G1R1F），如图25所示。当细胞的信号模式为一红一融合信号模式（1R1F）或一红两融合信号模式（1R2F）时，也记为阳性信号，如图26所示。当细胞的信号模式为两绿两红信号模式（2G2R）或两绿两红两融合信号模式（2G2R2F）时，也记为阳性信号，如图27所示。

图25

图26

图27

典型的ALK阴性信号模式为两融合信号模式（2F），如图28所示，当细胞出现2号染色体扩增，杂交信号表现为多融合信号模式也记为阴性信号。当细胞含有一个黄色信号和红绿信号出现弥散的形式并相近，这种杂交信号记为阴性信号，如图29所示。当细胞的杂交信号表现为一绿一融合信号模式（1G1F）或一绿两融合信号模式（1G2F）时，记为阴性信号，如图30所示。当细胞里的荧光信号只有红色或者绿色信号时，如图31所示，这样的细胞不能作为计数细胞。

图28

图29

图30

图31

总结ALK分离探针结果判读标准如下：

计数50个肿瘤细胞，统计计数细胞中阳性和阴性细胞数目，计算Ratio值（Ratio=计数细胞中阳性细胞数目/计数细胞数×100%）

① ALK基因融合阳性

Ratio>50%时，可认为该组织为ALK基因融合阳性；

② ALK基因融合阴性

Ratio<10%时，可认为该组织为ALK基因融合阴性；

③ ALK基因融合结果不确定

Ratio在10%~50%时，需重新选择细胞区域，再计数50个细胞，两次计数结果累加，

Ratio<15%时，可认为该组织为ALK基因融合阴性；

Ratio≥15%时，可认为该组织为ALK基因融合阳性。