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以ALK融合基因检测浅谈PCR、IHC和FISH方法的优劣
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发布时间：2018-07-17
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目前指南推荐FISH检测作为ALK融合基因的标准方法，非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗已进入到个体化治疗的时代。肺癌中ALK变异主要为ALK基因发生重排与其他基因融合。其中，EML4-ALK（棘皮动物微管结合蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶）融合基因变异是其主要类型，约占所有NSCLC的5%左右[1]。ALK阳性的NSCLC虽然仅占全部NSCLC的5%，但是每年新发病例数在中国仍接近30,000例[2]。因此，如何准确诊断ALK阳性的NSCLC便成了临床上的当务之急。
目前针对ALK融合基因检测常用的方法有三种—荧光原位杂交（FISH）、基于PCR扩增技术（RACE-PCR或RT-PCR联合测序技术、qRT-PCR等）和免疫组织化学法（IHC）。
上述三种方法各有其优缺点。简单来说，FISH是临床试验验证的金标准方法；RT-PCR对标本取材要求较高，需专用的试剂盒进行检测，且只能检出已知的融合；IHC虽简便易行，但阳性标准不统一。
先来看看几项临床研究：
在2014年，法国的雷恩大学医学院在国际肺癌研究协作组的专业期刊Journal of Thoracic Oncology发表了一篇重要文章。对法国两家独立的中心，共3244例非小细胞肺癌样本进行ALK检测，利用两种不同方法进行了平行分析比较。
总结如下：
▶ALK总阳性率为150/3244(4.6%)
▶在这150例ALK阳性病例中：
80/150 （53%）FISH+/IHC + ；36/150（24%）FISH +/IHC-
19/150 （12.6%）FISH-/IHC +；15/150（10%）FISH fail/IHC+
以上面的数据来初步分析：针对ALK检测，IHC的假阴性率高达24%；FISH的假阴性率为12.6%。因此如果仅仅以IHC作为用药指导，将近有四分之一的ALK阳性病人无法使用ALK靶向治疗。
到底以哪一个方法为准？其实很简单，我们以疗效为准。
▶在FISH + / IHC + 的患者中，有34/80例接受了克唑替尼的ALK治疗，31/34有直接药物疗效反应，临床判定为治疗有效。
▶在FISH + / IHC - 的患者中，有6/36例接受了克唑替尼的ALK治疗，4/6有直接药物疗效反应，临床判定为治疗有效。另外两位后来发现有复发及再次诊断为鳞癌。
▶在FISH - / IHC+ 的患者中，有2/19例接受了克唑替尼的ALK治疗，2/2有直接药物疗效反应，临床判定为治疗有效。但这两位患者带有ALK多倍体，且>6个细胞有融合信号，但是未达到15%的FISH阳性判读阈值。
综合以上数据，FISH的方法在敏感性及特异性上更高一些。所以我们要强调的是，FISH的诊断相对于IHC来说，它是一种更加客观的方法，而IHC的结果判定更加主观一些。
2018年新指南明确指出：FISH、IHC或基于序列特异性的PCR技术均可作为ALK阳性肺癌的诊断技术，检测实验室应该根据组织标本类型选择合适的检测技术。当怀疑一种技术的可靠性时（如FISH的肿瘤细胞融合率接近15％时），可以考虑采用另一种技术加以验证。
指南中三种方法总结如下：
荧光原位杂交
目前指南推荐FISH检测作为ALK融合基因的标准方法[4]。ALK FISH技术适用的组织样本类型：10％中性福尔马林固定后石蜡包埋标本（FFPE样本），防脱玻片切片厚度3~5μm。
原位杂交技术检测ALK融合也存在不足之处。例如传统FISH检测对于操作和判读技术要求较高，且耗时长。但随着近年来生物技术的发展，一些快速探针的问世也大大缩短了FISH实验的时间，将传统的过夜杂交时间缩短为2小时，为临床诊断提供了更加及时可靠的帮助，使FISH阳性的患者能从靶向药物明显获益。
免疫组织化学法
免疫组织化学法（IHC）因其具有简便易行、价格便宜、操作方法成熟等特点，成为潜在有效的筛查方法。但IHC也有其局限性，例如早期的ALK融合蛋白的IHC抗体敏感性较低（ALK1, Dako），因此不适宜用于ALK融合基因的检测[6]。
采用IHC法需注意以下两点：第一，由于ALK的蛋白表达与神经外胚层的分化有关，故其可能在小细胞肺癌和正常人的脑组织中存在表达。因此，不建议在小细胞肺癌中使用ALK融合蛋白的IHC检测。第二，常规IHC的阳性标准判定尚未统一。
实时荧光定量逆转录聚合酶链反应
RT-PCR方法检测ALK融合基因的特点在于快速、简便易行、能同时明确ALK已知的融合变体的类型。由于PCR扩增存在污染和RNA降解等原因，RT-PCR检测存在一定的假阳性和假阴性。
此外，目前在NSCLC中已陆续发现了20多种不同的ALK融合变体，不能排除仍有未知融合变体的存在，与FISH方法能检出所有的融合的特点相比，无法检测未知的融合型是RT-PCR最大的不足之处。这些因素限制了RT-PCR在ALK融合基因诊断中的应用。
指南推荐ALK检测的总体原则：应综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子检测方法的特点、实验室自身条件，进行多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，以保证ALK融合型肺癌的检出率和准确率。
最后来简单总结下IHC、FISH和(q)RT-PCR检测方法的特点及优劣
| 项目 | FISH | IHC | (q)RT-PCR |
| 临床符合率 | 高，金标准 | 低 | 高，存在假阳性 |
| 检测费用 | 高 | 低 | 高 |
| 可检测的融合型 | 所有融合型 | 所有融合型但不能区分 | 已知的融合型 |
| 所需组织量 | 厚度3-5μm石蜡切片 | 厚度3-5μm石蜡切片 | 100-500ng RNA |
| 优点 | 灵敏度和特异性高 | 操作简便、价格便宜 | 结果判读简单 |
| 不足之处 | 检测费用高，能检出所有的融合但不能区分 | 判定标准主观、阳性标准不统一 | 无法检测未知的融合型、对RNA质量和检测环境要求高 |
参考文献：
1. Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identif cation of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer[ J]. Nature, 2007,448(7153): 561-566.
2. Chabner BA. Early accelerated approval for highly targeted cancer drugs[ J]. N Engl J Med, 2011, 364 (12): 1087-1089.
3. Savic S, Bode B, Diebold J, et al. Detection of ALK-positive nonsmall-cell lung cancers on cytological specimens: high accuracy of immunocytochemistry with the 5A4 clone[ J]. J Torac Oncol, 2013, 8(8): 1004-1011
4.Camidge DR, Bang YJ, Kwak EL, et al. Activity and safety of crizotinib in patients with ALK-positive non-small-cell lung cancer: updated results from a phase 1 study[ J]. Lancet Oncol, 2012, 13(10): 1011-1019.
5. Shaw AT, Kim DW, Nakagawa K, et al. Crizotinib versus chemotherapy in advanced ALK-positive lung cancer[ J]. N Engl J Med, 2013,368(25): 2385-2394.
6. Rodig SJ, Mino-Kenudson M, Dacic S, et al. Unique clinicopathologic features characterize ALK-rearranged lung adenocarcinoma in the western population[ J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(16): 5216-5223.
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