2017年12月下旬，Bayer和Loxo Oncology公司合作开发的口服选择性原肌球蛋白相关激酶（Tropomyo-sin-related kinase，Trk）抑制剂Larotrectinib在美国递交新药上市申请、用于治疗携带NTRK融合基因的成人或儿童实体瘤。之前Larotrectinib已被FDA授予孤儿药资格和突破性疗法认定。该事件是精准医学走向实践的重要一步，也是基于精准医学设计的创新性临床试验-篮子试验（Basket Trial）的又一伟大实践。

Larotrectinib的疗效数据早在2017年6月的ASCO会议就已公布：在I期和II期临床试验中，共招募了55例涉及13种不同肿瘤类型的NTRK融合患者，包括垂体腺瘤（12人）、肉瘤癌（10人）、婴儿纤维肉瘤（7人）、肺癌（5人）、甲状腺癌（5人）、结直肠癌（4人）、黑色素瘤（4人）、胆管癌（2人）、胃肠道间质瘤（2人）、其他癌症（4人），其中46个可评估的患者整体反应率为78%，有2位患者肿瘤完全消失，最长应答时间达23个月。

紧接着，2018年10月举行的欧洲肿瘤医学协会会议（ESMO2018）上，一项关于抗癌药Larotrectinib治疗涵盖24种独特肿瘤类型的TRK融合成人，及儿童患者的临床数据显示：总缓解率：80%；部分缓解率：62%；完全缓解率：18%。临床数据充分证明了Larotrectinib用药持久的有效性和安全性。

Larotrectinib是一个靶向药，针对的是NTRK1、NTRK2或者NTRK3基因融合的肿瘤患者。简单来讲这个新药不需要考虑癌症的发生区域，这就意味着不管什么癌种（组织/细胞/部位），只要有NTRK基因融合，就可使用Larotrectinib进行治疗。

Larotrectinib说明书中也明确指出其适应征：

所以，晚期不可手术癌症患者可做基因检测，如果有NTRK1/2/3融合基因，那么就可考虑使用Larotrectinib进行靶向治疗。因此基因检测是用药的前提， 那么基因检测是如何指导用药就需要了解两个问题：1. 什么是NTRK融合基因？ 2.NTRK融合基因如何检测？

1.什么是NTRK融合基因？

原肌球蛋白相关激酶 (tropomyosin-related kinase,Trk) 是一类神经生长因子受体，其家族由高度同源性的原肌球蛋白相关激酶A(tropomyosin-related kinase A, TrkA)、原肌球蛋白相关激酶 B (TrkB)、原肌球蛋白相关激酶C(TrkC)组成，分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3编码（图A）。Trk激酶通过配体所诱导的二聚化发生自我磷酸化，从而激活Ras/MAPK、P13K/AKT、PLCγ等下游信号通路，参与细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生命活动（图B）。当染色体异常发生NTRK基因融合，与NTRK融合的配偶体可模拟配体诱导的二聚化而发生自我磷酸化，即可不接受配体的介导激活下游通路，促进细胞增殖分化，最终导致肿瘤的发生（图C）。Larotrectinib具有Trk激酶抑制活性，通过与ATP竞争结合位点实现抑制激酶催化活性，从何抑制肿瘤的发生。

NTRK基因融合出现在多种成人和儿童实体瘤之中，包括乳腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌，以及各种肉瘤中（表1）。

在常见的癌症中，NTRK基因融合的发生率较低，大致为1%-3%；但在一些罕见的癌症中，如婴儿纤维瘤，类似乳腺分泌癌，乳腺分泌型癌等，NTRK基因融合的发生率可达90%以上（表2）。

2.NTRK融合基因如何检测？

目前NTRK融合基因检测方法有：NGS、FISH、RT-PCR、IHC几种，但Larotrectinib说明书中仅指出检测方法为NGS和FISH，Larotrectinib临床试验中也将二者作为NTRK融合阳性患者筛选方法。

下面以几个临床案例来探讨各方法在检测NTRK基因融合中的应用。

案例一：

男性，45岁，30年吸烟史，在2013年被诊断出患有IV期肺腺癌；

进行四项化疗，疾病进展并脑转移；

AMP：SQSTM1-NTRK1，FISH进一步确定NTRK1重排；

进行Entrectinib  400mg/㎡ PO daily治疗；

使用Entrectinib治疗，分别是治疗7天（图A/C),26天（图C/D），155天（图E/F)的胸部CT，上排为横断面，下排为冠状面。CT结果显示肿瘤明显减少。表明Entrectinib对携带SQSTM1-NTRK1基因的NSCLC患者显示出显着的抗肿瘤活性。

案例二：

36例肺腺癌患者使用NGS检测2例含有NTRK1重排，分别为MPRIP-NTRK1和CD74-NTRK1融合基因（图a），并同时运用NTRK1断裂探针进行FISH检测显示绿色（5'）和红色（3'）信号明显分离，证实了MPRIP-NTRK1和CD74-NTRK1重排（图b）。

案例三：

41岁女性，诊断为具有转移至肺的软组织肉瘤的肿瘤;NGS检测LMNA-NTRK1基因融合（图A）;NTRK1 FISH显示在肿瘤细胞核中观察到分离的红色信号（红色箭头）（用DAPI染成蓝色），表明染色体缺失导致NTRK1基因融合（图B）;以LMNA（5'）和NTRK1（3'）为引物的RT-PCR产物的DNA测序色谱图表明LMNA的外显子2和NTRK1的外显子11之间融合（图C）。

使用Larotrectinib治疗，CT扫描显示胸腔横断面和冠状面图像，分别为开始LOXO-101临床试验之前（A），在研究中给予Larotrectinib治疗之前的基线成像（B），以及给药后1个周期（28天）（C）和4个周期（4个月）（D）的基线成像。图像显示最初为快速疾病进展（A-B，13周间隔），随后是显着的肿瘤减小，大量肺转移的肿瘤减小或分辨率降低（B-D，4周和16周间隔）。

以上三个案例均同时采取AMP-FISH及NGS-FISH方法联合检测策略，最终确定NTRK阳性的患者，从何进行靶向用药，且用药受益良好。

小结FISH，NGS和PCR方法优劣：

1. FISH：

高敏感性和特异性，NTRK的融合形式很多，较RT-PCR而言FSIH方法能检出所有的融合形式，FISH NTRK1/2/3商品化探针的出现为FISH方法的应用提供了较好的保障。NTRK1/2/3 FISH技术适用的组织样本类型：10％中性福尔马林固定后石蜡包埋标本（FFPE样本），防脱玻片切片厚度3-5μm。

目前传统FISH检测对于操作和判读技术要求较高，且耗时长。但随着近年来生物技术的发展，一些快速探针的问世也大大缩短了FISH实验的时间，可将传统的过夜杂交缩短为2小时，为临床诊断提供了更加及时可靠的帮助，使FISH阳性的患者能从靶向药物明显获益。

2. NGS：

灵敏度高、可发现丰度较低的融合基因reads、目前临床实验使用占较大比例，但并没看到不同丰度reads的融合对疗效有何影响的相关报道。一般而言，NGS检测需从FFPE或新鲜样本中提取几十ng以上的RNA，用于建库及捕获。然而，不同大小的NGS panel往往需要设计RNA或DNA探针，来捕获这三个基因，特别是较大的NTRK2和NTRK3基因（DNA片段分别长达39万和35万碱基对），外显子较多，融合类型复杂且分布不一，且只能针对已知融合位点（序列）设计捕获探针，成本较高，且不同厂家的panel性能可比性还有待积累。Loxo Oncology公司在官方网站上也罗列了10种NGS panel供参考，在国内相关NGS独立实验室的panel性能还未见有较权威的验证数据发表。

3. RT-PCR

RT-PCR法检测NTRK1/2/3融合基因的特点在于快速、简便易行、能同时明确NTRK1/2/3已知的融合变体的类型。由于RT-PCR对于RNA的质量要求较高，结果容易出现假阴性和假阳性。此外，NTRK1/2/3融合变体很多，不能排除仍有未知融合变体的存在，相比FISH方法检测NTRK1/2/3融合基因能检出所有的融合的特点相比，无法检测未知的融合型是RT-PCR最大的不足之处。这些因素限制了RT-PCR在NTRK1/2/3融合基因诊断中的应用。

NTRK1/2/3检测的总体原则：应综合获取的各类生物材料的特征、分子检测方法的特点、实验室自身条件，进行多学科大协作，合理采取有效检测方法和流程，当怀疑一种技术的可靠性时，可以考虑采用另一种技术加以验证。

推荐采用多种方法（FISH+NGS+PCR)联合检测NTRK1/2/3融合,避免NTRK1/2/3阳性患者漏检，丧失治疗机会。